Métodos de observación de rutina y precauciones del cultivo celular.
Métodos de observación de rutina y precauciones del cultivo celular.
Después de inocular o subcultivar las células, el experimentador debe realizar un examen de rutina de las células todos los días o como máximo 1 ~ 2 días. Observe la morfología y el crecimiento de las células, así como el cambio de pH del cultivo, si hay contaminación, etc. De acuerdo con los cambios dinámicos de las células, realice el reemplazo de líquidos o el tratamiento de pasaje. Si se encuentran condiciones anormales, tome medidas a tiempo.
1. Las células con buen estado de crecimiento morfológico se pueden ver bajo el microscopio general, con gran transparencia, fuerte refracción y contorno poco claro. Cuando las células crecen mal, el contorno mejora, las vacuolas, las gotas de lípidos y otras partículas a menudo aparecen en el citoplasma, la brecha entre las células aumenta y la morfología celular es irregular o incluso pierde sus características originales, como las células epiteliales se vuelven epiteliales como células. Cuando las células mueren, algunos tintes pueden combinarse con el ADN nuclear desintegrado a través de la membrana celular desnaturalizada y hacer que se coloreen. Por lo tanto, el azul de tripano se usa a menudo para identificar células muertas y vivas. Las células vivas no se tiñen y los núcleos muertos son azules.
2. El crecimiento celular después del cultivo primario o la inoculación de la suspensión de células subcultivadas, comenzó a proliferar después de diferentes períodos de incubación. Las líneas celulares de paso, los tejidos embrionarios o los tejidos larvales generalmente ven un crecimiento celular al día siguiente y se pueden unir en pedazos en una semana. Después de que las células inoculadas crezcan por toda la pared de la botella, deben volver a cultivarse a tiempo. De lo contrario, debido al consumo de nutrientes y la acumulación metabólica, las células entrarán en el período de parada o degradación. En este momento, se realza el contorno de la célula y a menudo aparecen depósitos granulares en las células, que son mitocondrias hinchadas. El citoplasma se vacuoliza y las células se vuelven redondas y ásperas. En casos graves, las células se caen de la pared de la botella. Solo subcultivando a tiempo las células pueden seguir creciendo y reproduciéndose.
3. En condiciones normales, la solución nutritiva es de color rojo melocotón. Si las células se mantienen a pH 6,5 ~ 6,6, las células se caerán y morirán. Cuando el medio de cultivo se acidifica y se vuelve amarillo, indica que los metabolitos en el medio de cultivo se han acumulado en una cierta cantidad y es necesario reemplazar el medio de cultivo nuevo. Si se agrega HEPES al medio de cultivo o se cultiva en una incubadora con CO2 al 5 %, el pH se puede mantener relativamente estable. El tiempo de cambio de solución nutritiva depende del consumo de nutrientes. Cuando la célula crece vigorosamente, se puede cambiar cada 2 ~ 3 días, y cuando el crecimiento es lento, también se puede cambiar cada 3 ~ 4 días. Se debe prestar especial atención a que varias células tienen diferentes requisitos para el valor de pH.
4. Contaminación microbiana después de la contaminación microbiana del cultivo de células cultivadas, el valor de pH cambiará y el medio de cultivo aparecerá turbio. Después de la infección bacteriana, debido al movimiento de las bacterias, hay un ligero destello bajo el microscopio óptico; En la infección por hongos, se observaron bajo el microscopio muchas hifas filamentosas y, a veces, esporas agrupadas; La contaminación por micoplasma solo se puede detectar con la ayuda de algunos métodos de detección. Después de la contaminación celular, generalmente debe desecharse. Para líneas celulares importantes, puede consultar monografías relevantes para introducir algunas medidas para eliminar la contaminación. Los experimentos importantes y las células preciosas deben ser cultivadas y operadas por al menos dos experimentadores de forma independiente, o por una persona en varias ocasiones (en diferentes momentos). Además de las condiciones sanitarias del laboratorio de cultivo, la humedad del aire está íntimamente relacionada con la contaminación microbiana. Los experimentos importantes y a largo plazo deben llevarse a cabo en otoño e invierno cuando la humedad del aire es baja.
Otras precauciones:
Primero, observe con frecuencia para determinar el estado de la celda.
En segundo lugar, si se deben agregar antibióticos. Esto depende de la situación. En el proceso de cultivo celular, se requiere agregar la menor cantidad posible de impurezas irrelevantes. Los antibióticos también son una carga para las células.
En tercer lugar, la descongelación del suero bovino fetal. El suero generalmente se almacena a -20 ℃ y se descongela en el refrigerador a 4 ℃, lo que lleva mucho tiempo y debe descongelarse con un día de anticipación.